分光光度分析

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在分光光度计中，将不同波长的光连续地照射到一定浓度的样品溶液时，便可得到与众不同波长相对应的吸收强度。如以波长（λ）为横坐标，吸收强度（A）为纵坐标，就可绘出该物质的吸收光谱曲线。利用该曲线进行物质定性、定量的分析方法，称为分光光度法，也称为吸收光谱法。用紫外光源测定无色物质的方法，称为紫外分光光度法；用可见光光源测定有色物质的方法，称为可见光光度法。它们与比色法一样，都以Beer-Lambert定律为基础。
近年来，紫外及可见光分光光度分析已得到广泛的应用，它不仅可以用于物质的鉴定及结构分析，而且还可以用于某些物质含量的测定。
分光光谱技术可用于：
1)通过测定某种物质吸收或发射光谱来确定该物质的组成。
一、紫外及可见光分光光度法
这是一种只在可见光及紫外光光谱应用范围内测量物质吸收辐射线的技术，应用十分广泛。其中分光光度计可用于精确测量特定波长的吸收值，而比色计则是一种较简单的测量仪器，其原理是利用虑光片来测量较宽波段（如可见光中的绿光、红光或蓝光范围）的吸收值。
光吸收法则：
溶液对光的吸收有两个基本法则：
1)透过溶液的光的吸收值同吸收溶质的分子数目（即溶质浓度[C]）呈指数相关。
这两条法则包括在比尔－朗伯关系式中。通常以入射光（Io）和出射光（I）的光密度来表示：
10(Io/I)=εl[C]
其中ε对于吸收物质及波长是一个常数，称为吸光系数或吸收系数，[C]的单位为mol/L或g/L，l的单位为ml。这一公式非常有用，因为大多数分光光度计设计为直接测量log10(Io/I)的值（A）或消光值（E）（旧教材中可能使用以废除的术语：光密度）。对于遵循比尔－朗伯关系的物质，A与C呈线性关系。吸收值常用下标表示其波长，如A550表示550nm处的吸收值。透过溶液的光的比例称为透光率（T），可由出射光和入射光的比值求得。
吸收值（A）（absorbance）——由公式得出：A=Log10(Io/I)
（一）比色计
比色计用于测定颜色明显，并且是溶液主要组分的待测物，如血液中的血红细胞，也可以在待测物之中加入一种试剂，使其形成有色产物（一种生色团），如用茚三酮法测定氨基酸含量。定量分析某种物质要做标准曲线，标准曲线是在测定待测样品的同时测定已知含量的物质来制成的，而不是使用比尔－朗伯关系。
光源通常为钨丝灯泡，通过一个凸透镜聚焦后产生一束平行光，平行光穿过装有溶液的玻璃样品或小池，然后透过一个有色滤光片到达光电管检测仪，检测仪产生一个同落在光电管上的光密度成正比的电势，来自于光电管的信号被放大然后传递到电流计或数字读数器。
比色计的使用：
①接通电源使仪器稳定，使用前至少要让灯预热5min；②选择一种同底物颜色互补的滤光器；③调零（用空白对照调零）；④调整灵敏度；⑤分析样品及标准溶液；⑥由于不同比色杯的吸光特性、杯壁厚度不同，因此为了提高精确度，同一试验应用同一比色杯，且在比色槽中摆放的方位相同；⑦每次测样前清洗比色杯；⑧经常重复测定同一溶液检验比色计的可重复性；⑨用标准溶液绘制标准曲线。
由于大多数过滤器过滤出来的光的波带很宽，因而比色计既不能用于确定某种复合物，也无法分辨在混合液中吸收特性非常相近的两种物质。比色计所用光电管的变化系数为0.5%左右，因而不适合要求具有高度精确性的工作。使用这种最简单的仪器，由于仪表上对数测量刻度单位的随意性，即使是把表上的灵敏度/刻度调节到零控点，在一个仪器上获得的值不可直接同另一台仪器上测得的值相比较，同一仪器的不同设置之间也不可直接比较。比色计对于特定波长的量化工作是不合适的。[/C]（二）紫外光/可见光分光光度计
紫外光/可见光分光光度计基本装置中采用高强度的钨灯作为光源，能够在可见光范围（400~700nm）调节。氘灯用于紫外分光光度测量（200~400nm）；使用氘灯时要用石英杯，因为紫外线不能透过玻璃。
分光光度计之所以优于比色计就在于使用了一个衍射光栅将光源的复色光转换为单色平行光束。实际上从这种单色一种产生的光不是某个波长的光，而是一段窄的带宽上的光，带宽是分光光度计的一个重要特性，这是由于它决定了吸收测量中所用的波长——普通分光光度计的带宽为5~10nm，用于研究的仪器的带宽小于1nm。
因为光栅夹缝的宽度影响着带宽，带宽随光栅夹缝的宽度的减少而降低，要获得特定波长下的精确数据，尽可能使用最小的缝宽度。然而，减少了缝宽也会减少到达监测器的光度，降低了信/噪比。缝宽可减少的程度取决于检测/放大系统的灵敏度及稳定性于离散光的存在。
大多数UV/可见光分光光度计使用的比色杯的光穿过路径为10nm。一次性塑料杯适合于对水和乙醇溶液在可见光范围内的测量。玻璃比色杯的生产要求更加严格的标准，因而在精确研究中要使用玻璃比色杯，尤其当溶液的吸收值很低时（